介绍一下‘反义寡核苷酸’
我是药化出身的，根子上还是做有机合成。不过对生化有所涉及；浏览这里，发现生化讨论区还是一片空白，就写点自己的入门文字，算是抛砖引玉吧！呵呵，我自己抛的就是砖，不怕生化血统的高人扔砖了[img]http://chem8.org/images/smilies/tongue.gif[/img]
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反义寡核苷酸（Antisense oligodeoxynuclecotide, AS ODN）是一段与mRNA或DNA特异性结合并阻断其表达的人工合成的寡核苷酸分子。它可以与细胞内某一特定的基因序列互补，因此可以在一定的条件下与DNA模板、RNA模板链，以碱基互补配对的方式结合，进而对基因的复制、转录及翻译等过程产生影响。反义寡核苷酸具有特异性抑制基因表达的能力,随着快速基因克隆、测序技术及快速自动DNA化学合成技术的出现，反义寡核苷酸的研究已进入蓬勃发展时期。反义寡核苷酸能通过封闭或抑制肿瘤细胞和病毒的关键编码基因来特异性抑制肿瘤细胞增殖和病毒的复制，是治疗肿瘤和病毒性疾病的潜在新型药物。目前在动物体内评价的反义药物有10余种，其中抗肿瘤作用的有7种，抗病毒作用的1种，其他如作用于心血管、代谢、免疫及细胞粘附系统的有4种。
一．反义寡核苷酸的分子机制
1． 物理阻断
反义寡核苷酸与特异序列的结合可能阻断mRNA或DNA与特异蛋白质、核酸或其它一些与mRNA代谢及功能有密切关系的细胞因子的结合，从而破坏正常的细胞生命过程。
1）干扰RNA剪接
真核生物mRNA中间代谢的重要步骤是切除内含子，这种剪接过程是序列特异性的，并需要特定的剪接体以及蛋白质的参与。因此，设计反义寡核苷酸，使之与靶序列中剪接所需要的特异性序列结合，有可能阻断剪接必需元件的结合或物理阻断剪接反应，从而重新定位剪接以改变基因的表达框架，这将抑制mRNA在体内的代谢，减少体内成熟mRNA的产量，或使mNRA表达缺乏特定功能区的蛋白质。
2）抑制翻译
真核生物的翻译包括起始、延长、终止3个步骤。一些反义寡核苷酸通过与翻译起始因子结合，阻止翻译起始，从而抑制基因表达。已经证明有多种反义寡核苷酸是通过干扰翻译起始发挥作用的，例如，多肽核酸等。
3）破坏RNA结构
细胞内mRNA形成各种复杂的三维结构，最常见的有茎-环结构，这些结构在生命过程中扮演着重要角色，对于机体RNA稳定以及RNA对蛋白质、核酸以及核蛋白的识别都有着决定性作用，因此，破坏RNA结构也有可能起到抑制基因正常表达的作用。其中一个例子是以HIV的TAR元件为作用靶点的反义寡核苷酸，能够与TAR结合并破坏其固有的结构，使其丧失功能，从而抑制TAR介导的基因表达，达到治疗HIV的作用。
2．加速mRNA的降解
1） 5ˊ帽
5ˊ帽是RNA修饰的重要步骤，5ˊ帽对于前体和成熟mRNA的稳定、RNA与核基质的结合以及mRNA的转运都起着重要作用。反义寡核苷酸对5ˊ帽结构的调节以及对5ˊ帽与蛋白质相互作用的调节可能影响多个生物事件，包括mRNA的稳定性降低等。
2） 3ˊ多聚腺苷酸尾
前体RNA 3ˊ非编码区最终在转录后修饰的过程中加上长的多聚腺苷酸尾，多聚腺苷酸尾有提高mRNA稳定性以及其他一些重要生物功能。理论上，与前体RNA 3ˊ非编码区结合的反义寡核苷酸，可以阻止3ˊ多聚腺苷酸尾的形成，从而降低mRNA的稳定性，加速其降解，从而失去生物学功能。
3） 其它结构
除了5ˊ帽和3ˊ多聚腺苷酸尾结构以外，已经证明，在3ˊ和5ˊ 非编码区还存在其它一些结构，影响成熟mRNA的稳定、mRNA与核基质的结合以及mRNA的转运起和翻译等过程，针对这些序列设计的反义寡核苷酸同样可以通过破坏其固有结构来影响mRNA的代谢。
3．激活RNase H
RNase H 是一种广泛存在的酶，在病毒和人体细胞中都有发现，能降解DNA/RNA复合物中的RNA链。真核细胞中有多种同工酶，在细胞核中浓度高，主要参与DNA的复制。RNase H 的精确识别元件并不是十分清楚，但只要有DNA特征的4个碱基的寡核苷酸就能激活 RNase H。RNase H 的激活受到多种因素的影响，如寡核苷酸的糖基化修饰，糖基对碱基方向的改变，反义寡核苷酸的骨架修饰等，都可以影响 RNase H 的活性。硫代反义寡核苷酸是 RNase H 的良好底物，现在认为诱导 RNase H 切割RNA是硫代寡核苷酸的主要机制。
4. 寡核苷酸诱导的切割
另一种诱人的机制是，经过化学改性的反义寡核苷酸衍生物可以直接对其靶序列进行切割。反义寡核苷酸与DNA结合可以形成三聚体形式，研究发现在反义 寡核苷酸的3ˊ-末端连接上化学切割试剂、乙二胺四乙酸、二价铁离子或邻菲罗琳的衍生物，在改性过程中需要铜离子和还原剂的存在，可实现对靶基因进行诱导切割等不可逆的反应，从而导致靶基因的失活。
二．反义寡核苷酸的修饰
反义寡核苷酸的化学修饰主要集中于磷酸二酯骨架、糖环和碱基的修饰。
1．碱基修饰
主要有杂环修饰、5-甲基胞嘧啶和二氨基嘌呤等，将可极化的基团加到碱基上可以增强碱基的堆积能力，提高杂交能力。
2．核糖修饰
主要为己糖、2′-O-甲基取代核糖、环戊烷、α构象核糖等，能提高对核酸酶的抗性或提高Tm值。
3．磷酸二酯键修饰
第一代主要为硫代和甲基代修饰，即磷酸二酯键的非桥氧原子被S、烷基、烷氧基等取代。第二代磷酸二酯键修饰不含P原子，能显著增强核酸酶的抗性，但多数修饰物与RNA的亲和力降低。
4．末端修饰
寡核苷酸-多肽缀合物主要利用天然多肽的内在性质提高反义寡核苷酸被细胞吸收的速度，增强稳定性等。
5．嵌合型反义寡核苷酸
具有代表性的第二代寡核苷酸，即在DNA链中插入2ˊ-保护的核糖核苷分子，两端2ˊ-OR （R=CH3，C2H5）修饰的RNA分子不仅使嵌合体对核酸酶的抗性，同时提高Tm值。中间是可以激活RNase H的硫代磷酸酯DNA序列。
6．异核苷掺入的寡核苷酸研究
将碱基由糖环的1ˊ位移到其他位置形成新型核苷类似物成为异核苷。异核苷能抵抗核酸酶的降解，表现出很好的酸、酶稳定性和抗肿瘤、抗病毒活性，由于它们在体内的稳定性和良好的生物活性，正日益受到人们的重视。我室合成了一系列异核苷化合物，并研究了它们的活性。
7．磷酸二酯骨架延长的寡核苷酸
有报道将核苷酸之间的连接由正常的4原子变成5原子连接的修饰物，是一类潜在的干扰RNA茎环结构的反义寡核苷酸。
三．反义寡核苷酸的选择
反义技术是阻断已知基因表达的有效方法，比基因敲除技术简单，但是在选择有效反义药物方面却面临着巨大的挑战，目前有以下一些方法：
1．随机“鸟枪”法
合成大量针对一个mRNA靶不同区域的寡核苷酸，通过活性的检测来寻找最优的反义寡核苷酸。这种方法的效率不高，通常只有2～5%是有效的反义寡核苷酸，相对而言，这种方法费时、费力和费钱。
2．计算机结构预测
使用RNA结构预测软件，例如 mfold，通过计算机模拟RNA分子的二级结构甚至高级结构，基于预测得到的RNA结构，针对其单链区设计反义寡核苷酸。这种方法受到很多因素的限制，例如，对于长的RNA分子，计算机会形成许多自由能相似的不同结构，很难判断哪一个是正确的折叠构象；而且，它不能模拟高级有序分子之间的相互作用，而这种作用也影响mRNA的可接近性。
3．寡核苷酸芯片扫描
扫描阵列由大量原位合成于固相介质上的一系列寡核苷酸组成，与靶序列杂交，杂交图由成像仪成像后，用计算机软件进行分析，并能对杂交敏感度进行定量分析。
4．寡核苷酸库/ RNase H 切割基础上的扫描
随机寡核苷酸库是一套长度固定的包含有所有可能序列的寡核苷酸，靶mRNA在体外转录，末端标记，与寡核苷酸库混合，通过引物延伸法或电泳方法鉴定切割位点。这种方法操作简单，但只能大致确定切割位点，因为 RNase H 可以在RNA/DNA杂交双链上的多个位点进行切割。
5．脱氧核酶法
脱氧核酶切割RNA的方式与核酶相似，有人针对HPV16 mRNA设计脱氧核酶并进行筛选。这种方法与使用寡核苷酸库实质上相似，但每一条核酶需要单独设计合成，因此相对比较烦琐。另外，RNA分子稳定的内部结构会抑制脱氧核酶的切割活性，而且，由于只针对嘌呤-嘧啶连接，这种方法不能检测到所有可接近的位点。
6．RNase T1足迹法
这种方法基于假设RNA上的单链区域是形成分子之间碱基配对的区域。但现在有证据表明，长单链区域并不倾向于形成杂交双链。
7．导向核酶库
“导向”核酶库克隆在一穿梭质粒载体上，从而可在哺乳动物细胞内表达。组建与靶点互补的片段库，可在活细胞中寻找寡核苷酸的可接近位点。但这种方法操作烦琐，周期长。
四．反义寡核苷酸与肿瘤研究
恶性肿瘤的发生与细胞内某些致癌基因的激活或某些抑癌基因的失活有关。反义寡核苷酸特异地阻断致癌基因的过度表达而不影响其他基因的正常功能。目前利用反义技术可以设计出与有害基因、突变基因、非正常表达基因及其mRNA互补的反义寡核苷酸，以封闭这些基因或阻断其表达。应用反义寡核苷酸治疗的恶性肿瘤病人已有慢性淋巴细胞性白血病、T淋巴细胞白血病、神经胶质瘤、膀胱癌、骨髓瘤、乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨癌和肺癌等，已经取得了一定的疗效。
针对肿瘤的反义药物的研究较早，迄今为止已有十几种反义寡核苷酸试用于临床。选择的反义靶点主要包括：
1．癌基因类：c-myc, c-myb, bcl-2, N-Ras, K-Ras, H-Ras, c-jun, c-fos, cdc-2和 c-mos 等；
2．宿主基因类：多药耐药基因、周期素(cyclin)、前胸腺素、T细胞受体、表皮生长因子受体、蛋白激酶C等；
3．细胞因子类：IL-2,IL-1α,IL-1β等；
4．病毒类：人T淋巴细胞病毒、Rous肉瘤病毒等；
5．抑癌基因类：p53等。
因此，反义寡核苷酸抗肿瘤作用的机制主要有以下几种：1）抑制癌基因，例如与原癌基因c-met mRNA 互补的反义寡核苷酸可达到遏制肿瘤生长效果；2）通过反义ras逆转亚性表型；3）通过靶向细胞信号转导抑制肿瘤生长；4）抑制生长因子表达，反义寡核苷酸可抑制生长因子，可能成为治疗激素非敏感性乳腺癌及前列腺癌的药物；5）抑制融合基因，靶向融合基因的反义寡核苷酸可抑制Ewing肉瘤和神经外胚层肿瘤细胞的EWS-Fli融合基因，可用于治疗这两种肿瘤；6）增强化疗效果，如反义寡核苷酸与化疗联合应用或使用针对MDR的反义寡核苷酸；7）其他，如抑制端粒酶；与bcl-2 mRNA互补的反义寡核苷酸下调其表达，减弱bcl-2的抗凋亡作用；削弱免疫抑制功能，使免疫恢复正常，等等。
五．反义寡核苷酸与病毒性疾病研究
自从1978年发现反义寡核苷酸在培养细胞中具有抑制ROSUS肉瘤病毒复制的活性以来，反义寡核苷酸抗病毒活性的研究日益引起人们的重视。由于病毒基因对人体是独特的，病毒基因的反义寡核苷酸对人类正常基因干扰的可能性极小，另一方面，许多病毒基因的序列及其基本概念已明确，这使作用于基因水平的抗病毒药物的合理设计成为可能。因此，病毒基因成为反义寡核苷酸作用的靶点引起人们的关注。反义技术的出现为抗病毒研究提供了新的策略。最新资料表明，有3种抗病毒反义核苷酸已批准进入临床评价阶段，他们分别针对艾滋病毒、巨细胞病毒和人乳头瘤病毒。
1.HIV
福米韦生（fomivirsen，ISIS2922）是FDA批准上市的第1个反义药物，由 21个硫代脱氧核苷酸组成，核苷酸序列为5’- GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’，主要用于治疗艾滋病（AIDS）病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎。HIV的反式激活蛋白反应序列（TAR）与TAT蛋白结合可促使HIV转录，当用反义TAR封闭TAR时，可终止HIV的转录，现已取得体外抗HIV的效果。
2. 流感病毒
流感病毒一直威胁人和动物的健康，主要因为它变异快，从而导致疫苗的保护性小或无保护性，为此科学家们正在积极研究一种针对病毒的PB1（是流感病毒在复制和转录中具有重要作用的多聚酶复合体的组成部分，具有高度的保守性，且在流感病毒各型中具有同源性）的反义寡核苷酸，导致病毒的复制受到抑制，从而达到抗病毒的作用。
3. 病毒性乙型肝炎
目前，我国乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的携带率将近全国人口的10%。目前在体外已大量研究了应用反义寡核苷酸抑制HBV基因的复制和表达，分别针对HBV基因的转录、反转录、翻译和包装等阶段设计反义寡核苷酸，研究的主要靶点有DR1、Pol、SP启动子转录mRNA帽区、S基因、C基因、Poly A增强信号区、RNA前导序列等。
4．人乳头瘤病毒
HPV16，18 E6/E7已被证实是转化基因，HPV-16以及HPV-18反义寡核苷酸能抑制HPV-18阳性的宫颈癌细胞在裸鼠上的致瘤能力和抑制HPV-16阳性的宫颈癌细胞在软琼脂上的集落形成能力。E6/E7反义寡核苷酸作用于宫颈癌细胞，使其恶性表型部分逆转。在美国用于治疗HPV感染相关疾病的反义制剂已进入II期临床。
5.冠状病毒
重症急性呼吸综合征的传染性强且死亡率相对高，引起了世界各国的高度重视。世界各国正努力研究病毒的生物学特征和可能的药物防治靶点及疫苗。位于美国俄勒冈州波特兰市的AVI生物制药公司表示已经把对付田鼠冠状病毒和企鹅西尼罗河病毒的反义寡核苷酸“改造”成了对付非典病毒的药物。
6. 其他
另外，反义寡核苷酸对病毒的抑制作用，已经在对SV40、腺病毒、仙台病毒、单纯疱疹病毒I型、II型和登革热病毒等的实验中得到证实。
六．反义寡核苷酸药物存在问题
反义寡核苷酸作为一种治疗药物用于抗肿瘤抗病毒治疗，是目前最有可能应用于临床的基因疗法，但在普遍应用于疾病治疗之前还需解决以下问题：
1．提高反义寡核苷酸在体内和细胞内的稳定性
反义寡核苷酸必须具有抵抗内源性核酸酶降解的能力。未经修饰的反义寡核苷酸在血清中半衰期只有几小时。目前采用化学修饰的方法来增强其在体内的稳定性，如硫代磷酸寡核苷酸、肽核酸等。
2．增强反义寡核苷酸导入靶细胞的能力和效率
反义寡核苷酸只有以一定数量进入细胞后才能产生作用。目前设计一些针对细胞特异受体的配基，增加反义药物的疏水性，使用脂质体或病毒载体等方法来增强反义寡核苷酸的细胞穿透能力。
3．反义寡核苷酸的安全性
目前，在体内反义物表达量控制仍是尚未解决的问题。在人体内大量使用，是否可产生严重不良反应至今了解不多，如化学修饰后反义核酸治疗效果提高，毒付作用能否同时增加等。许多实验室正在进行这方面的研究工作。
另外，作为药物必须合成足够量，并要降低成本，反义寡核苷酸的专一性效能和非专一性作用的意义，反义寡核苷酸的作用机制以及反义寡核苷酸作为药物在管理中的特殊问题等都需要解决。
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回复 #1 whoknowme 的帖子
我原来是做糖类为载体的核苷类药物，不会是一个实验室出来的吧：）页:
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